Вариабельность пластика для (количественной) ПЦР и молекулярной диагностики (MDx)

    Осетрина бывает только первой свежести. Вторая свежесть — вздор!  Свежесть бывает только одна — первая, она же и последняя.

«Мастер и Маргарита», М.А. Булгаков

 

Теперь давайте рассмотрим вторую «физическую» составляющую процесса ПЦР – пластик. (О первой составляющей подробнее здесь.)

Обычно при выборе пластика используется не так много критериев – разве что обращают внимание на «свободный от ДНК, РНК, ДНКаз, РНКаз, пирогенов и металлов». Некоторые предпочитают стерильный (различие в этих терминах смотрите ниже), а иногда – пластик с «максимальной сохранностью» образца — Maximum recovery  (хотя не совсем понятно, а что же это такое и от чего зависит?).

Какие еще параметры «обыкновенного / стандартного» лабораторного пластика – пробирки и наконечника – могут повлиять на результат?

Для ответа на этот вопрос давайте более детально рассмотрим функции пробирки и наконечника – после этого будет понятно, какие параметры важны для получения достоверных результатов в рамках гармонизации процесса ПЦР или кПЦР.

Пробирка

Основные функции пробирки – сохранение образца и его равномерный прогрев – в соответствии с заданной температурной программой. Для этого пластик должен обеспечивать:

    • Исключить потери на всех этапах
    • Поддержание заданной температуры реакционной смеси во всех пробирках – теплообмен реакционной смеси и термоблока
    • Минимальное испарение
    • Максимальное соотношение Сигнал/Шум
    • Легкость и удобство работы – сохранение здоровья сотрудников
    • Экономия реагентов
    • Масштабирование эксперимента, то есть переход от индивидуальных пробирок к стрипам, от стрипов к формату 96-луночного планшета — без модификаций или оптимизации уже подобранных условий
    • Универсальность, то есть наличие пластика для всей лабораторной базы пользователя (всех амплификаторов и дозаторов в лаборатории) у одного поставщика.

Давайте рассмотрим, как обеспечивается каждый из этих параметров в продукции BIOplastics (Нидерланды).

 

Инертность внутренней поверхности пробирки

Инертность играет ключевую роль в процессе ПЦР и зависит от качества сырья и качества обработки поверхности, ведь связывание молекул нуклеиновых кислот и белков происходит именно на «неровностях» внутренней поверхности пробирок и «неоднородностях» состава полипропилена – то есть, примесях.  У пластика BIOplastics количество инородных групп на поверхности на порядки меньше, чем у других производителей.

В отличие от ряда других производителей, делящих свой ПЦР пластик на «стандартный» и «низкого связывания» (maximum recovery или low binding), у BIOplastics есть только один пластик для кПЦР (Как говорил классик – «Осетрина бывает только первой свежести. Вторая свежесть — вздор! Свежесть бывает только одна — первая, она же и последняя. А если осетрина второй свежести, то это означает, что она тухлая!»).

Так же и с пластиком для ПЦР – либо он подходит для ПЦР, либо нет.

Весь ассортимент продуктов для ПЦР у BIOplastics изготовлен из смеси полипропиленов ULA – Ultra-Low Adhesion, обладает сверхнизким связыванием, позволяет работать даже с единичными молекулами (Single Cell analysis). Связывание пластика ULA – менее 0,3 % – это в разы меньше связывания продуктов «особых» категорий maximum recovery или low binding других производителей и в десятки раз меньше, чем у простого медицинского полипропилена высокого качества.

Производство BIOplastics изначально было разработано для производства высококачественного пластика именно для кПЦР и молекулярной диагностики (MDx) с использованием самых передовых технологий и know-how, а не адаптация устаревших технологий для требований ПЦР,  как это происходило у большинства других производителей. В настоящее время значительное количество компаний-производителей диагностических наборов (MDx) по всему миру  выбирают именно продукцию BIOplastics!

В первую очередь, качество пластика BIOplastics достигается за счет использования особой смеси медицинских полипропиленов самого высокого качества. Состав этой смеси – knowhow компании BIOplastics, именно эта смесь позволяет получить сверхнизкое связывание (ULA) без поверхностных обработок и усиление соотношения сигнал/шум при использовании матового и белого пластика без использования красителей, которые потенциально могут выступить в качестве ингибиторов ПЦР.

Этот уникальный состав также позволяет получить намного более ровную поверхность непосредственно в процессе литья – без дополнительной обработки, а также делать более тонкие стенки для лучшего теплообмена.

Теплообмен между термоблоком и пробиркой

 Угол контакта пробирки и термоблока

При неплотном прилегании стенки пробирки к поверхности лунки термоблока образуется зазор, который не позволит передавать тепло от термоблока к реакционной смеси. Причем, при несоответствующем угле конуса пробирки, зазор будет максимальным как раз снизу –  там, где находится реакционная смесь – то есть смесь будет прогреваться неравномерно.
BIOplastics выпускает особо точные пробирки с минимальными отклонениями – EU – Extreme Uniform – Особо однородный. У этих пробирок, в отличие от пробирок других производителей – не EU, всегда плотный контакт с термоблоком по всей поверхности пробирки.

prob1

Однородность толщины стенок

Помимо изменения зазора, у обычных пробирок «non-EU», наблюдается вариабельность толщины стенок от пробирки к пробирке, что приводит к перегреву смеси через более тонкую часть пробирки. Тогда как в пробирках EU толщина стенок у всех пробирок всегда одинакова, и реакционная смесь во всех пробирках во всех экспериментах прогревается равномерно,  что обеспечивает точный и  воспроизводимый результат.

prob2

 

Испарение – толщина стенок.

prob3

Для обеспечения максимально быстрого теплообмена реакционной смеси и термоблока необходима минимальная толщина стенок. При этом, разумеется, пробирка не должна деформироваться. Однако, через любой пластик происходит диффузия паров растворителя (воды) и через тонкие стенки всегда будет высокая диффузия. Для решения этой проблемы в пробирках BIOplastics нижняя часть сделана тонкая – для улучшения теплообмена, а верхняя – толстой – для минимизации испарения и изменения концентрации образца.

Низкий профиль пробирок

Основным преимуществом пробирок низкого профиля, по сравнению со стандартным и высоким, является уменьшенный объем над реакционной смесью. Это значительно снижает количество реакционной смеси, переходящей в газовую фазу. Как следствие, можно проводить реакции в меньших объёмах, уменьшается концентрирование компонентов реакционной смеси в результате испарения, улучшается точность и воспроизводимость результатов.

prob4

 

Дизайн крышки

Толщина, закругленные края, уплотнительная кромка

Тонкая крышка пробирки EU обладает хорошей теплопроводностью, внутренняя поверхность хорошо прогревается нагреваемой крышкой термоциклера и препятствует конденсации паров.

Закругленные края облегчают циркуляцию паров и предотвращают конденсацию паров по внешнему краю крышки, сохраняя постоянную концентрацию образца на протяжении всего анализа.

Уплотнительная кромка особого профиля переменной толщины рассчитана так, что при увеличении внутреннего давления она дополнительно «запирает» пробирку, уплотняя контакт со стенками, что также минимизирует испарение через зазор крышки и пробирки.

prob6

Оптическая область крышки

Оптическая область крышки пробирки имеет максимальную площадь (12,6 кв.мм) и минимальную толщину (0,3 мм) – это позволяет флуоресцентному сигналу проходить практически без потерь и получать максимальное соотношение Сигнал/Шум.

Углубленная оптическая область предотвращает  ее касание при работе и минимизирует риски загрязнения при закрывании.

prob7

Зависимость соотношения Сигнал/Шум от типа пластика

Белый или матовый?

Белый пластик, изготовленный по технологии BPLPM (BIOplastics particle mix), дает максимальное отражение сигнала и увеличение Сигнал/Шум в три и более раз.

 

Распределение флуоресцентного сигнала в зависимости от типа пластика пробирок:

prob8

 

Давайте теперь рассмотрим разницу между стерильностью и отсутствием ДНК, ДНКаз, РНКаз, апирогенность. Стерильность – отсутствие всех видов микроорганизмов.


Стерильность или отсутствие ДНК, ДНКаз, РНКаз?

Отсутствие ДНК, РНК, ДНКаз, РНКаз, металлов, апирогенность – это отсутствие даже фрагментов любых нуклеиновых кислот, а также ДНКаз, РНКаз, ионов металлов и пирогенов. Если сравнить параметры «стерильность» и «отсутствие…», мы увидим, что второй – намного более строгий, чем простая стерильность. Действительно, ведь как после простого автоклавирования, так и после стерилизации гамма-излучением или этиленоксидом, пластик станет стерильным – то есть в нем не будет никаких потенциально опасных микроорганизмов. Однако, в нем могут присутствовать «остатки» этих микроорганизмов – например, в виде фрагментов их ДНК. И эти фрагменты могут быть успешно реплицированы в процессе ПЦР, что даст нам ложные результаты.

Таким образом, мы видим, что понятие «отсутствие ДНК, РНК, ДНКаз, РНКаз, металлов и пирогенов» — намного шире, чем просто стерильность, и полностью включает этот термин в себя. А вот стерильный продукт вполне может содержать фрагменты ДНК и быть не пригодным для ПЦР.

Отдельно, следует отметить, что процесс автоклавирования не удаляет фрагменты ДНК, то есть нельзя использовать пластик после автоклавирования для постановки ПЦР. Также, с большой вероятностью в процессе автоклавирования из пластика могут выделиться некоторые реагенты — пластификаторы и пр., которые могут оказать существенное влияние на процесс ПЦР. Особенно много таких примесей в дешевых расходных материалах. Все имеет свою справедливую цену, и высокое качество не может быть дешевым. Не всегда стоит переплачивать за Майбах, но и рассчитывать приобрести Тойоту по цене Жигулей, по меньше мере, наивно.

 

Легкость и удобство работы – сохранение здоровья сотрудников от  RSI – травмы лучезапястного сустава

Легкое открывание-закрывание крышек пробирок помогает сохранить здоровье сотрудников. Все, кто работал в лаборатории, знают, насколько сложно открыть-закрыть несколько десятков или сотен пробирок за день. Нередки профессиональные травмы лучезапястного сустава – RSI — repetitive strain injuryхроническая травма от повторяющегося напряжения», «синдром карпального канала», «туннельный синдром».)  С пластиком BIOplastics вероятность такой травмы сведена к минимуму.

 

Экономия реагентов

Используя пластик от BIOplastics Вы можете экономить до 60% дорогостоящих реагентов.

 

Масштабирование эксперимента. Переход: «пробирки – стрипы – плашки»  без модификаций условий.

Используя пластик BIOplastics, Вы можете легко масштабировать эксперимент от стадии оптимизации процесса к стадии скрининга и анализа любой производительности. Все пробирки, стрипы, отрывные стрипы, планшеты и планшеты-трансформеры  у BIOplastics сделаны абсолютно одинаковыми, поэтому, взяв вместо пробирок стрипы или планшеты, Вы получите абсолютно такой же результат.

А используя систему калибровки ПЦР, Вы можете легко ставить Ваш эксперимент на любом амплификаторе,  поскольку Ваш метод привязан к реальной температуре реакционного процесса, а не к прибору.

Универсальность. Наличие пластика для всех амплификаторов и дозаторов у одного поставщика.

В каждой лаборатории находится множество приборов различных производителей. Зачастую процесс закупки необходимого пластика связан с большими временными затратами, поскольку покупать приходится у разных поставщиков. BIOplastics – пожалуй, единственный производитель с наиболее широким ассортиментом пластика для любых амплификаторов и дозаторов. Поэтому Вы можете сэкономить значительное количество времени и средств, заказывая все необходимое у одного поставщика.

 

Стоимость Вашего спокойствия и Вашей репутации

По соотношению цена/качество у продукции BIOplastics нет конкурентов.

Понятно, что стоимость высококачественной продукции не может быть низкой, и было бы странно пытаться конкурировать по цене с продукцией других производителей, расположенных в Азии, Латинской Америке или других бюджетных местах массового производства с сомнительным соблюдением технологического процесса и сомнительным контролем качества.

Поскольку Вы приобретаете не просто «лабораторный пластик», а возможность сосредоточиться на Вашей работе и не беспокоиться о возможных «странных результатах», то цена за экономию Вашего времени и сохранение Вашей репутации, наверняка не такая уж и высокая.

Даже если у Вас «все прекрасно» – наверняка время от времени Вы получаете «странные результаты», которые не всегда можете объяснить. В этом случае у Вас возникает множество возможных причин – проблемы с прибором, пластиком, плохо прошла реакция, неудачная пробоподготовка, плохой образец, некачественные реагенты, или что-то еще (влияние магнитного поля Земли или лунного цикла). В результате, чаще всего анализ приходится переделывать — эксперимент затягивается, вновь тратятся дорогостоящие реагенты.

Работая с пластиком производства BIOplastics на калиброванном амплификаторе, Вы будете уверены, что проблем с оборудованием или пластиком у Вас точно нет, значит, можно сосредоточиться на реагентах, дизайне эксперимента или его реализации. Таким образом, Вы экономите свое время (а время = деньги), и намного быстрее движетесь вперед! Мы уверены, что Ваше время – это самый ценный (к тому же, не возобновляемый) ресурс, и делаем все, чтобы помочь Вам его сэкономить.

Наша компания проводит гибкую финансовую политику и готова предоставить индивидуальные условия для каждого нашего клиента. С нами сотрудничают как крупные научные центры (СПбГУ, МГУ,  Институты СО РАН и др.) и биотехнологические предприятия,  в том числе производители диагностических наборов), так и небольшие государственные и частные лаборатории.